8-氧化咖啡因和嘧啶類生物堿在普洱熟茶中的存在
普洱茶是以云南大葉茶[ Camellia sinensis(Linn .) var. assamica (Masters ) Kitamura ] 為原料制作的茶類。普洱茶可分為普洱生茶(Pu-Er raw tea) , 普洱陳茶( Pu-Er aging tea ) 和普洱熟茶(Pu-Er ripe tea) 等三大系列(楊崇仁等, 2006 )。普洱生茶是未經(jīng)過發(fā)酵生產(chǎn)的曬青毛茶, 既可作為綠茶飲用又可通過后發(fā)酵過程轉(zhuǎn)化為普洱陳茶或普洱熟茶。普洱熟茶則是由普洱生茶經(jīng)過微生物參與的后發(fā)酵過程生產(chǎn)得到的。
我們曾對普洱茶的化學(xué)成分進(jìn)行研究, 從普洱生茶中分離到大量的酚類成分, 包括: ( + )兒茶素、( – ) 表兒茶素(EC)、(± ) 沒食子兒茶素(GC)、( – ) 表沒食子兒茶素( EGC)、( – ) 表兒茶素-3-O-沒食子酸酯( ECG)、( – ) 表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯(EGCG) 、( – ) 表阿福豆素-3-O-沒食子酸酯、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄吡喃糖甙、蘆丁、山奈酚、山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖甙、山奈酚-3- O-蘆丁糖甙、小木麻黃素( saictinin)、l , 6-O-二沒食子?；?β-D-葡萄吡喃糖、茶倍素、綠原酸、3α, 5α-二羥基-4-α-O-咖啡?；痣u納酸、松柏醇甙、沒食子酸; 以及咖啡因( 周志宏和楊崇仁, 2000)。
普洱熟茶的化學(xué)成分與普洱生茶有顯著的差別, 我們曾報道金雞納素( cinchonain) 型的酚類化合物, 包括普洱茶素( puerin) A ( 1) 和B ( 2) ,以及epicatechin – [7, 8-bc ] -4α- (4-hydroxyl-phenyl ) -dihydro-2 (3H ) -pyranone (3 ) 和cinchonain Ib (4) ,為普洱熟茶的特征成分( 圖1 )。其中, 化合物1和2 為新化合物, 3～4 系首次從茶科植物中分離得到。從普洱熟茶中我們還分離到( + ) -兒茶素(C)、( – ) 表兒茶素( EC) 、(± ) 沒食子兒茶素(GC)、( – ) 表沒食子兒茶素( EGC)、( – ) -表沒食子酸葡萄糖甙、沒食子酸、山奈酚、山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖甙、山奈酚-3-O-蘆丁糖甙、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄吡喃糖甙、楊梅素(myricetin)、2 , 2′, 6 , 6′-四羥基二苯和2 ,5-二羥基苯甲酸等酚類化合物, 以及咖啡因(Zhou 等, 2005; 林智等, 2006) 。
為了進(jìn)一步闡明普洱熟茶的物質(zhì)基礎(chǔ), 系統(tǒng)的化學(xué)研究仍在深入進(jìn)行中。本文在已有的工作基礎(chǔ)上, 報道從云南省雙江縣產(chǎn)的普洱熟茶中新分離得到的生物堿和酚性化合物。
普洱熟茶成分
圖1 普洱熟茶中的特征成分
1 實(shí)驗(yàn)部分
1 . 1 儀器與材料
1D, 2D-NMR 譜在氘代溶劑( CD3 COCD3 + D2O,CD3OD) 中用Bruker AM-400 和DRX-500 核磁共振儀測定, TMS 為內(nèi)標(biāo), 化學(xué)位移δ用ppm (10 – 6 ) 表示, 偶合常數(shù)J 用Hz 表示。質(zhì)譜在VG Auto Spec-3000 質(zhì)譜儀上測定。柱層析用Diaion HP20SS (Mitsubishi Chemical Co .) ,MCI-gel CHP-20 ( 75 ～ 150 μm, Mitsubishi Chemical Co .) ,
Sephadex LH-20 (25～100 μm, Pharmacia Fine Chemical Co .Ltd .) , Chromatorex ODS ( 100 ～ 200 mesh , Fuji Silysia Chemical Co . Ltd .) 和硅膠H ( 青島海洋化工廠) , 薄層層析用預(yù)制硅膠板H (0 . 20～ 0 . 25 mm, 青島海洋化工廠) , 薄層層析展開劑為苯- 乙酸乙酯- 甲酸或氯仿-甲醇- 水, 顯色劑為5%三氯化鐵乙醇溶液或5%硫酸乙醇溶液, 加熱顯色。
普洱熟茶樣品由云南省臨滄市雙江縣雙江勐庫茶廠生產(chǎn)。
1 . 2 提取和分離
普洱熟茶( 10 kg ) 用60% 丙酮室溫冷浸3 次, 過濾, 合并濾液, 減壓回收丙酮后通過Sephadex LH-20 柱層析, 以MeOH-H2 O (1∶0～0∶1) 和50%丙酮梯度洗脫,得到11 個組分( Fr. 1-11 )。Fr .1 經(jīng)MCI-gel CHP-20P,Sephadex LH-20 和Chromatorex ODS 等柱層析反復(fù)分離,MeOH-H2O 系統(tǒng)洗脫, 得到化合物5 (7mg) , 6 (10 mg) , 7(54 mg) 和8 (5 mg) 。Fr . 2 用MCI-gel CHP-20P 和SephadexLH-20 , Chromatorex ODS 等柱層析反復(fù)分離, 以MeOHH2O 梯度洗脫, 純化得到化合物9 (2 mg) 和12 (15mg)。Fr . 8 用MCI-gel CHP-20P, Toyopearl HW-40F 和SephadexLH-20 柱層析反復(fù)分離, MeOH-H2O 洗脫, 得到10 ( 7mg)。同樣, 從Fr . 10 部分得到化合物11 (11 mg)。
1 . 3 鑒定
胸腺嘧啶脫氧核苷( deoxythymidine ) (5) , 白色粉末,FAB- MS m/z 241 [M-H] – ; 1 H NMR ( 400 MHz,CDCl3 ) δ8 . 33 ( s, H – 6) , 1 . 85 ( s , H – 7) , 6 . 55 ( t , J = 6 . 9 , 6. 7 Hz,1′- H) , 2 . 60 (m, 2′- H) , 4 . 75 (m, 3′- H) , 4 .26 ( m, 4′-H) , 4 . 06 (dd , J = 11 . 8 , 3. 21 Hz, 5′- H) 和13 C MR ( 100MHz, CDCl3 ) δ12 . 1 (C – 7 ) , 39 .9 (C- 2′) , 71 .2 (C- 3′) ,85 . 8 (C- 1′) , 87 . 5 (C – 4′) , 111 . 0 (C- 5) , 137 . 5 (C – 6 ) ,151 . 5 (C- 2) , 165 . 5 (C- 4) 。(崔征等, 1995)
胸腺嘧啶( thymine ) (6) , 白色粉末, EI-MS m/z 126;1H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ8. 46 ( s, H – 6) , 1. 76 ( s, H -7 ) 和13 C NMR (100MHz, CDCl3 ) δ153 .6 (C- 2) , 166 . 6 (C- 4) , 109 .0 (C- 5) , 138 . 9 (C- 6) , 12 .5 (C- 7)。
?? 尿嘧啶( uracil ) (7 ) , 白色粉末, 負(fù)離子, FAB+ -MS m/z 113 [M+ H] + ; 1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ5 . 42 (d ,J = 7 . 6 Hz, H – 5) , 7 . 36 (d , J = 7 . 6 Hz, H – 6) 和13 C NMR(100MHz, CDCl3 ) δ151 .5 (C- 2) , 164 . 4 (C- 4) , 110 . 0 (C- 5) , 142 .2 (C- 6)。
8-氧化咖啡因( 8-oxocaffeine ) ( 8 ) , 白色粉末, 負(fù)離子FAB- MS m/z 209 [M-H] – ; 1 H NMR ( 400MHz, CD3 Cl3 )δ3 . 17 ( s, NMe ) , 3 . 32 ( s, NMe ) , 3 .34 ( s , NMe ) 。13 CNMR ( 100 MHz, CDCl3 ) δ 28. 2 (Me ) , 28 . 6 ( Me ) , 31 .2(Me) , 100 . 1 (C – 4) , 148. 3 (C – 5) , 151 . 5 (C – 2) , 154 .7
(C- 6) , 162 . 0 (C- 8)。(Stadler and Fay, 1995)
黃杞甙( engeletin ) ( 9 ) , 黃色粉末, 負(fù)離子, FAB-MS m/z 431 [M-H] – ; 1H NMR ( 400 MHz, DMSO- d6 ) , δ6 . 27 ( br s , H – 6) , 6 . 46 ( br s, H – 8) , 6 .88 ( d , J = 8 .6Hz, H- 2′) , 7 . 78 ( d , J = 8 . 6 Hz, H – 3′) , 7 .78 ( d , J =8 . 6 Hz , H – 5′) , 6 . 88 ( d , J = 8 .6Hz, H- 6′) , 5 .01 ( d , rhaH- 6′) , 5 .01 ( d , rhaH – 1) , 1 .22 ( d , J = 6. 0 Hz, rha H – 6 )。(Krishnamachari等, 2002)
1 , 2 , 4-苯三酚( 1 , 2 , 4-benzenetriol ) ( 10 ) , 白色粉末, 負(fù)離子FAB- MS m/z 125 [M-H] – ; 1 H NMR ( 400MHz, CD3OD) : δ6 . 89 (H, br s, H- 3) , 7 . 07 (1H, d , J =8 . 2 Hz , H- 4) , 6 .05 (1H , d , J = 8 . 2 Hz, H – 6) 。
?? 1 , 3-苯二酚(1 , 3-benzenediol ) ( 11) , 白色粉末, 負(fù)離子FAB- MS m/z 109 [ M-H ] – ; 1H NMR ( 400 MHz,CD3OD) , δ6 . 78 (2H , d , J = 8 .9 Hz , H- 2 , 4) , 8. 35 (1H,d , J = 8 .9 Hz, H – 3) , 7 . 35 (1H, br s, H – 6) 。
?? 4-甲基-1 , 2-二苯酚( 4-methyl-1 , 2-benzenediol ) ( 12 ) ,白色粉末, 負(fù)離子FAB- MS m/z 124 [M-H] – ; 1 H NMR(400MHz, CD3OD) :δ7. 38 (1H, brs , H – 3) , 6. 84 (1H, d ,J = 8 .2 Hz, H – 5) , 7 .32 (1H, d , J = 8 . 2 Hz, H – 6 ) ; 13 CNMR (100MHz, CD3OD) : δ149 .6 ( s , C- 1) , δ144 . 5 ( s, C- 2) , 115 .5 ( d , C- 3) , 123. 9 ( s , C- 4) , 123. 4 ( d , C- 5) ,117 . 2 ( d , C- 6) , 50 . 2 ( q , C- 7) 。
2 結(jié)果與討論
云南省雙江縣產(chǎn)的普洱熟茶的丙酮提取物,經(jīng)Sephadex LH-20 , MCI-gel CHP-20P, ChromatorexODS, 和Toyopearl HW-40F 等柱層析反復(fù)分離,得到8 個化合物, 包括8-氧化咖啡因( 8-oxocaffeine) ( 8) (Stadler and Fay, 1995) , 以及嘧啶類生物堿: 胸腺嘧啶脫氧核苷( deoxythymidine ) ( 5 ) ,胸腺嘧啶( thymine ) ( 6) 和尿嘧啶( uracil ) (7 ) ,黃酮類配糖體: 黃杞甙( engeletin) (9 ) (Krish-namachari , 2002 ) , 以及簡單酚類化合物: 1 , 2 , 4-苯三酚(1 , 2 , 4-benzenetriol ) ( 10)、1 , 3-苯二酚(1 , 3-benzenediol ) ( 11 ) 和4-甲基-1 , 2-二苯酚(4-methyl-1 , 2-benzenediol ) (12 ) ( 圖2 )。這些化合物均為首次從普洱熟茶中分離得到。
化合物5～12
圖2 從云南省雙江縣產(chǎn)普洱熟茶中分離得到化合物5～12
已知茶葉中富含嘌呤類生物堿類化合物,如: 咖啡因、可可堿、茶堿、黃嘌呤、烏便嘌呤等。已報道8-氧化咖啡因( 8 ) 為咖啡在炒制、磨碎和速溶等加工過程中由咖啡因氧化形成的,是加工咖啡的標(biāo)志性成分, 具有顯著的抗氧化活性, 至今尚未從茶葉中分離到。我們從普洱熟茶中首次分離到8-氧化咖啡因(8 ) , 顯然是普洱茶在高溫高濕的后發(fā)酵過程中, 在微生物的作用下經(jīng)生物轉(zhuǎn)化形成的產(chǎn)物, 對于普洱熟茶的品質(zhì)和生理活性評價有著重要的意義。
嘧啶類生物堿( 如: 尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶等) 亦存在于茶葉等高等植物中。而核苷和脫氧核苷則是微生物和動物生殖細(xì)胞的構(gòu)成成分, 極少在植物中發(fā)現(xiàn)。該類化合物參與DNA 代謝過程, 是DNA 和RNA 的組成, 具有顯著的生理活性(Kinahan 等, 1981)。胸腺嘧啶脫氧核苷( 5) 主要存在于海洋生物中, 也有報道從貝母和竹葉菜( Smilacina atropurpurea ) 中分離得到( 崔征等, 1995; 饒志剛等, 1997; 嚴(yán)忠紅等, 1999; 楊順利和劉錫葵, 2003 ) , 是抗AIDS 病藥物Stavudine and Zidovudine (AZT) 合成的中間體。我們從普洱熟茶中首次分離到胸腺嘧啶脫氧核苷( 5) , 有可能是茶葉中的嘧啶類生物堿與微生物中的核苷類化合物在后發(fā)酵過程中縮合形成的。
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